요점
- 원심 농축 필터는 농축뿐 아니라 버퍼 교환·탈염에도 씁니다. 농축 → 새 버퍼로 채우기 → 다시 농축을 되풀이합니다.
- Cobetter는 탈염·버퍼 교환에 3 · 10 · 30 kDa MWCO를 권합니다.
- 한 번 할 때마다 처음 버퍼는 「남은 부피 ÷ 채운 부피」만큼 줄어듭니다. 침전이 잘 되는 단백질은 덜 농축하고 횟수를 늘립니다.
들어가며
지난 글에서는 원심 농축 필터의 MWCO(분자량 컷오프)를 고르는 법을 다뤘습니다. 원심 농축 필터는 시료를 진하게 만드는 데만 쓰는 도구가 아닙니다. 버퍼를 바꾸거나 염을 빼는 데(탈염)에도 그대로 쓸 수 있습니다.
정제가 끝난 단백질을 다음 실험에 맞는 버퍼로 옮겨야 할 때, 따로 장비를 꺼내지 않고 원심분리기 하나로 끝낼 수 있습니다. 오늘은 그 순서와 몇 번 되풀이하면 되는지를 정리했습니다.
1. 버퍼가 바뀌는 원리
원심 농축 필터의 막은 큰 분자는 막 위에 남기고, 물과 작은 분자는 아래로 내려보냅니다. 염 같은 작은 분자도 물과 함께 막을 빠져나가고, 단백질은 막 위에 남습니다. 그래서 농축한 시료에 새 버퍼를 채워 다시 돌리면 처음 버퍼는 점점 줄고 새 버퍼로 바뀝니다.
Cobetter는 탈염·버퍼 교환에 3 · 10 · 30 kDa MWCO를 권합니다. 이 가운데에서 남길 단백질 분자량의 절반 이하인 것을 고르면 됩니다(지난 글의 규칙).
2. 시작 전에 준비할 것
- 필터 헹구기: 원심 농축 필터의 막에는 보호용 글리세롤이 조금 들어 있습니다. 처음 쓸 때 물이나 버퍼를 넣고 한 번 돌려 헹굽니다.
- 막은 계속 젖은 상태로: 헹군 뒤에는 막이 마르지 않게 바로 이어서 씁니다.
- 새 버퍼 넉넉히: 한 번 채울 때마다 필터 용량만큼 들어가므로, 되풀이할 횟수만큼 미리 준비합니다.
- 로터 확인: 15 mL 제품은 고정각 로터에서 12 mL까지만 넣습니다. 원심력은 2 · 4 · 15 mL 기준 고정각 5,000 xg, 스윙 버킷 4,000 xg이고, 4 · 15 mL의 100 kDa는 3,000 xg 이하입니다.
3. 버퍼 교환 5단계
- 시료 넣기: 헹군 필터에 시료를 넣습니다.
- 농축: 원심분리해 부피를 줄입니다. 막이 드러날 만큼 바짝 말리지 않습니다.
- 새 버퍼 채우기: 처음 부피까지 새 버퍼를 채우고 피펫으로 살살 섞습니다.
- 다시 농축: 같은 조건으로 다시 돌립니다. 2~4단계를 원하는 만큼 되풀이합니다.
- 회수: 마지막 농축이 끝나면 피펫 팁이 막에 닿지 않게 시료를 받습니다. 필요하면 마지막 단계에서 원하는 농도까지 더 농축합니다.
4. 몇 번 되풀이하면 될까
한 번 「농축 → 채우기」를 할 때마다 처음 버퍼는 「남은 부피 ÷ 채운 부피」만큼으로 줄어듭니다. 예를 들어 계산하면 아래와 같습니다.
| 예시 (남은 부피 ÷ 채운 부피) | 1번 뒤 | 2번 뒤 | 3번 뒤 |
|---|---|---|---|
| 4 mL 제품: 4 → 0.2 mL 농축 후 4 mL 채움 (1/20) | 약 5% | 약 0.25% | 약 0.013% |
| 15 mL 제품(고정각): 12 → 0.3 mL 농축 후 12 mL 채움 (1/40) | 약 2.5% | 약 0.06% | 약 0.002% |
| 덜 농축할 때 (1/10) | 약 10% | 약 1% | 약 0.1% |
횟수를 정하는 기준
※ 염 같은 작은 분자가 막을 자유롭게 통과한다고 가정하고 직접 계산한 값입니다. 실제 시료에서는 달라질 수 있습니다.
표에서 보듯 한 번에 많이 줄일수록 횟수가 줄어듭니다. 다만 너무 진하게 농축하면 단백질이 엉기거나 가라앉을 수 있으니, 침전이 잘 되는 단백질은 덜 농축하고 횟수를 늘리는 편이 안전합니다. 다음 실험에서 남아도 되는 양을 기준으로 횟수를 정하세요.
5. 시료를 잃지 않는 습관
- 귀한 시료는 일부만 먼저: 조건을 정한 뒤 전체를 돌립니다.
- 중간에 섞기: 새 버퍼를 채운 뒤와 돌리는 사이에 피펫으로 살살 섞어 줍니다.
- 아래로 빠진 액은 결과 확인까지 보관: 회수가 낮으면 단백질이 막을 빠져나갔는지 확인할 수 있습니다.
- 엉김이 보이면 멈추기: 시료가 뿌옇게 변하면 더 농축하지 말고 버퍼 조건(pH·염 농도 등)을 다시 봅니다.
상담 전에 적어 두면 좋은 것
- 남길 단백질과 분자량
- 시작 시료량과 원하는 최종 부피
- 바꿀 버퍼(또는 빼야 할 염)
- 쓰시는 원심분리기와 로터(고정각·스윙 버킷)
- 한 달에 쓰실 수량
자주 묻는 질문
몇 번 해야 하나요?
다음 실험에서 남아도 되는 처음 버퍼의 양으로 정합니다. 위 표처럼 한 번에 많이 줄일수록 횟수가 줄어듭니다.
MWCO는 무엇으로 고르나요?
3 · 10 · 30 kDa 가운데 남길 단백질 분자량의 절반 이하인 것을 고릅니다.
15 mL 제품은 얼마나 넣나요?
스윙 버킷 로터는 15 mL, 고정각 로터는 12 mL까지입니다.
Cobetter는 어떤 회사인가요?
Cobetter(Hangzhou Cobetter Filtration Equipment Co., Ltd.)는 2003년에 설립된 중국 항저우의 여과 전문 기업입니다.
Cobetter(Hangzhou Cobetter Filtration Equipment Co., Ltd.)는 2003년에 설립된 중국 항저우의 여과 전문 기업입니다.
