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Leaders in Ubiquitin Proteasome Research

LifeSensors사는 UPS (Ubiquitin Proteosome System)을 이용한 drug discovery 관련 제품 및 서비스 제공에 중점을 둔 바이오업체입니다. 500여 가지의 제품을 취급하며, 단백질 및 유비퀴틴 친화성 제품군 (ubiquitin affinity reagents; TUBEs), inhibitors, 검출 키트, 독보적인 단백질 발현 시스템 등을 주로 취급하고 있습니다. 또한 drug discovery 관련 서비스 및 각종 assay 제품들을 취급하고, UPS (ubiquitin proteosome system), PROTAC (proteolysis-targeting chimeric molecules) 스크리닝 플랫폼 개발에 역점을 두고 있습니다.


⊙ Ubiquitin and Ubiquitin Chains


유비퀴틴(Ubiquitin)은 이 분자의 C- 말단을 통해 표적 단백질에 있는 리신의 ε-아미노 그룹에 결합하는 작은 폴리 펩티드입니다. 표적 단백질에 유비퀴틴이 결합하는 것을 단일 유비퀴틴화라고 합니다. 그 이후에, 다른 유비퀴틴의 표면에 노출된 7 개의 리신 잔기 (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) 중 임의의 것과 초기 유비퀴틴이 결합할 수 있습니다. 이러한 유비퀴틴 사슬 형성을 폴리 유비퀴틴화라고 합니다. 유비퀴틴들의 결합은 일련의 효소 (ubiquitin activating enzyme E1, ubiquitin conjugating enzyme E2, ubiquitin ligase E3)에 의해 이뤄집니다. 세포내에서 단백질의 유비퀴틴화는 가역적으로 일어납니다. Mono-ubiquitin이나 poly-ubiquitylated chain은 둘 다 deubiquitylase(DUB)에 의해 가수분해 되어 절단됩니다.


LifeSensors사는 E1, E2, E3 enzymes 및 DUB를 포함한 모든 수준의 유비퀴틴 경로에 관여하는 효소에 대한 상당한 경험을 가지고 있습니다. LifeSensors사의 단백질 정제에 대한 광범위한 지식을 통해 약 30여개의 E2 효소, 20 개의 E3 효소 및 35 개의 DUB를 생산할 수 있습니다. 또한 LifeSensors사의 광범위한 분석 기법을 통해 효소 활성을 확인하고 E2-E3 쌍의 호환성을 결정하는 과정을 단순화하여, 연구자분들이 탐구하려는 구체적이고 중요한 생물학적 문제를 가장 잘 해결할 수 있게 효소를 선택하도록 보장합니다.


LifeSensors사는 결합 상호작용 연구를 위한 DUB-resistant polyubiquitin chain, DUB assay나 스크리닝(fluorophores and reporter enzymes)를 위한 ubiquitin conjugates, DUB 특이성이나 binding assay를 위해 여러 형태의 유비퀴틴 사슬 (di, tri, tetra-ubiquitin chains), E3 ligase 실험이나 DUB 선택적인 분석 실험을 위한 site-specific lysine ubiquitin mutants 등의 다양한 유비퀴틴 유도체(ubiquitin derivatives)를 개발하고 있습니다.


SUMO Technology and Difficult to Express Proteins


재조합 단백질의 생산시 단백질 응집체(inclusion bodies), 부정확한 단백질 형태, 숙주 세포에 대한 독성, 낮은 단백질 수득율 등의 문제에 일상적으로 직면합니다. 이러한 문제들은 대체 숙주를 사용하거나 관심 단백질 (POI, protein of interest)을 carrier protein (fusion tag)에 유전적으로 융합시켜 해결합니다. 관심 있는 단백질의 N-말단에 SUMO (작은 분자량의 유비퀴틴 유사 변형체, small ubiquitin like modifier)의 C-말단을 부착하면 단백질의 용해도가 획기적으로 향상되고, 자연상태로의 단백질 접힘을 달성하며, 발현량을 개선하고 분해를 감소시킴으로써 총 수득율을 증가시킵니다. LifeSensors는 원핵과 진핵 발현 숙주 모두에서 수많은 재조합 단백질의 양과 품질을 증가시키는 SUMO 융합 기술을 개발했습니다.


LifeSensors의 SUMO-tag 발현 시스템은 대장균에서 높은 용해도를 갖는 기능성 단백질의 수득율을 극대화합니다. SUMO는 단백질 접힘을 위한 개시자 및 샤페로닌으로 작용하여 POI의 용해도와 수득율을 향상시킵니다. De-sumoylases는 SUMO 태그를 제거하여 N-말단에 원하는 아미노산으로 구성된 단백질을 만들어 줍니다. SUMO 태그와 de-sumoylases 모두 6x His 태그를 가지고 있어 효율적인 후속 제거를 가능케 하여, 순수한 단백질을 만듭니다.


▶ SUMO Pro 시스템은 대장균에서 단백질 발현 및 정제

▶ SUMO Star 시스템은 진핵생물 숙주에서 단백질 발현 및 정제


모든 진핵세포에는 SUMO 및 SUMO protease가 포함되어 있기에 SUMO protease에 의해 발현 직후 SUMO 융합단백질이 절단되어 LifeSensors에서는 진핵생물 숙주용 발현 시스템으로 SUMO Star를 개발하였습니다.

SUMOStar 시스템은 내인성 protease에 내성이 있으며, 용해도가 증가하고 자연상태의 접힘을 이룹니다. SUMOStar 융합 단백질은 SUMOstar protease에 의해서만 절단됩니다.


다양한 숙주에 따른 발현 시스템 선택

 

 E.coli

 1. SUMOstar

 2. SUMOpro3

 3. SUMOpro

 

 Yeast

 1. Saccharomyces intracellular  SUMOstar

 2. Pichia pastoris secretory SUMOstar

 

 Insect

 1. Insect intracellular SUMOstar

 2. Insect secretory SUMOstar

 Mammalian

 1. Mammalian intracellular SUMOstar

 2. Mammalian secretory SUMOstar



SUMOpro®를 사용하여 E.coli에서 단백질 발현량 증가와 용해도 증가



[출처: Marblestone et. al., Protein Sci. 2006 Jan; 15(1) : 182-9]


⊙ PROTAC® Drug Discovery

"  PROTAC is a registered trademark of Arvinas Operations, Inc. and is used under license. "

PROTACs (Proteolysis-targeting chimeric molecules)는 UPS (Ubiquitin Proteasome System)의 구성요소를 인위적으로 포획하여 표적 단백질을 분해하는 기술입니다. PROTAC drugs은 linker를 통해 연결된 2개의 기능적인 리간드를 포함하는 이중 기능의 저분자입니다; 한 리간드는 타겟 단백질에 결합하고, 다른 리간드는 E3 ligase에 결합합니다. 이론적으로 이 두 개체가 인접함으로 인해 타겟 단백질의 폴리 유비퀴틴화가 일어나고 그로 인해 프로테아좀에서 타겟 단백질의 분해가 발생합니다. 그러나 세포내 복잡성을 감안할 때, 이 시나리오가 항상 발생하는 것은 아니며, PROTAC을 사용한 개발 전략에는 몇 가지 해결해야 할 난제들이 있습니다.​


한 예로;

1. PROTAC 분자가 의도한 파트너 분자와 결합하지 않거나

2. E3 ligase와 타겟 단백질이 서로 가까이 위치하는 것이 항상 유비퀴틴 매개 분해로 이어지지 않거나

3. PROTAC 분자는 타겟 단백질의 유비퀴틴화를 유도하지만, 잘못된 위치 및/또는 잘못된 폴리 유비퀴틴 연결을 초래하는 경우가 발생할 수 있습니다.




이러한 문제를 해결하기 위해, LifeSensors사는 타겟 단백질의 폴리 유비퀴틴화와 분해를 모니터링 할 수 있는 high-throughput tool를 개발했습니다. Plate 기반 포맷으로 단백질의 유비퀴틴화를 측정함으로써 PROTAC 기반의 약물 개발을 가속시킬 수 있습니다. LifeSensors사는 세포내 유비퀴틴화 뿐만 아니라 체외에서의 유비퀴틴화를 신속하게 정량적으로, 모니터링 할 수 있도록 하는 다양한 플랫폼을 개발하고 있습니다.

품목코드 품목명 규격명 이미지
1000A pE-SUMOpro Amp Kit (Fusion tag: His6-SUMO) kit
1100A pE-SUMOstar Amp Expression Kit (Fusion tag: His6-SUMOstar) kit
SM101 Biotin SUMO protein capture reagent 200 µg
PC1001 MZ1, PROTAC® Compounds 1 mg